elisa实验步骤

一、elisa实验步骤介绍

　　样品收集、处理方法

　　1、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，室温血液自然凝固10-20分钟，2000-3000rpm离心20分钟，将血清和红细胞迅速小心地分离，收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　2、血浆：根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂。混合10-20分钟后，2000-3000rpm离心20分钟。收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　3、细胞上清液：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2000-3000rpm离心20分钟，收集上清。

　　4、组织匀浆：标本采集后用液氮迅速冷冻保存备用。使用时取适量标本，加入一定量的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分后，2000-3000rpm离心20分钟，收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

二、样品保存

　　如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

　　实验步骤

　　1、从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需酶标板孔数目，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

　　2、标准品和样本加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，空白孔不加。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3、加酶：标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔。

　　4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。

　　5、配液：将20X浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。

　　6、洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

　　[洗板方法]

　　手工洗板：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，酶标板倒扣在吸水纸上拍干，反复5次。

　　自动洗板：每孔注入洗液350μL，浸泡1分钟，洗板5次。

　　7、显色：每孔加入底物A、B各50μL，轻轻震荡混匀后，37℃避光孵育15min。

　　8、终止：每孔加入终止液50μL，终止反应，此时蓝色立刻转为黄色。

　　9、测定：以空白孔调零，15分钟内在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

三、elisa实验结果计算

　　绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

四、elisa实验步骤注意事项

　　1、试剂盒保存在2–8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，属于正常现象，可水浴加热使结晶*溶解后再使用。初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

　　2、要严格避免操作过程中酶标板干燥，干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。

　　3、禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。

　　4、本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用;剩余的酶标板请放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

　　5、请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。